Sterilizzazione mediante calore

1. L’incenerimento: si bruciano gli organismi distruggendoli fisicamente. Usato per aghi , anse, vetreria, etc. e altri oggetti che non ne risentono nella struttura.
2. La bollitura: 100°C per 30 minuti. Uccide ogni cosa eccetto alcune endospore (Veramente, se si vuole purificare l’acqua 100°C per cinque minuti è adeguato sebbene ci sono stati casi di cisti di Guardia che sono sopravvissute). Per uccidere le endospore, e perciò sterilizzare la soluzione, viene richiesta una bollitura lunga e intermittente.
3.  L’autoclave (vapore sotto pressione or pentola a pressione): 121°C per 15 minuti. Buono per sterilizzare quasi ogni cosa, tranne le sostanze termolabili che verranno denaturate o distrutte.
4. Calore secco (forno d’aria calda): 160°C/2ore or 170°C/1ora. Usata per vetreria, metallo, e oggetti che non fondono.

Il protocollo e le raccomandazioni d’uso del calore per la sterilizzazione sono in questa tabella.

 Il calore è l'agente sterilizzante più efficace e più utilizzato. Se consideriamo gli effetti della temperatura sulla vitalità cellulare, sappiamo già che, quando la temperatura supera la temperatura massima che consente la crescita iniziano a manifestarsi fenomeni di letalità. Come è illustrato nella Figura, la letalità dovuta all'innalzamento di temperatura è una funzione esponenziale o di primo ordine, cioè il numero di cellule che muoiono aumenta in progressione geometrica in funzione del tempo di esposizione; dalla stessa figura si può, inoltre, osservare che la morte delle cellule è tanto più rapida quanto più aumenta la temperatura. Poiché la cinetica di mortalità illustrata nella Figura è una relazione di primo ordine possiamo dire che, ad una data temperatura, la frazione di cellule che muoiono in ogni intervallo di tempo è proporzionale solo al numero di cellule presenti in quel momento e che, quindi, il tempo necessario per uccidere una determinata frazione di cellule (per esempio, il 90%) è indipendente dal numero iniziale di cellule. Queste considerazioni hanno importanti conseguenze pratiche: infatti, il tempo necessario per una sterilizzazione sarà più lungo se si opera a bassa temperatura piuttosto che a temperatura più alta. E` quindi, necessario determinare il tempo e la temperatura di trattamento per ottenere una sterilizzazione efficace. Anche il vettore usato per la diffusione del calore è importante, il calore umido infatti ha un potere di penetrazione maggiore del calore secco.

Il metodo più utile per caratterizzare l'inattivazione dovuta al calore consiste nel determinare il tempo necessario per uccidere una precisa frazione della popolazione. In questo senso il parametro più utilizzato è il tempo di riduzione decimale (D) cioè il tempo necessario per ridurre di dieci volte il numero delle cellule vitali. Nell'intervallo di temperature solitamente utilizzato per la sterilizzazione degli alimenti, la relazione tra D e la temperatura è esponenziale; quindi, ponendo in grafico il logaritmo di D contro la temperatura, la funzione che si ottiene è quella di una retta (Figura).  La pendenza della retta fornisce una indicazione quantitativa della sensibilità al calore dell'organismo in esame nelle condizioni adottate. Grafici di questo tipo vengono utilizzati per calcolare i tempi di sterilizzazione necessari in diversi processi, come ad esempio nella sterilizzazione dei cibi in scatola.

Sebbene il metodo descritto sia accurato, la sua attuazione è piuttosto laboriosa, in quanto è necessario allestire un numero molto elevato di conte vitali.

Un metodo meno preciso, ma di più facile attuazione, consiste nel determinare il tempo di inattivazione termica, cioè il tempo necessario per uccidere tutte le cellule di una popolazione a una data temperatura. Questo dato viene ottenuto semplicemente scaldando per tempi diversi delle aliquote di una sospensione batterica, ogni aliquota viene poi inoculata in una provetta contenente il terreno colturale e incubata. Il campione che dopo incubazione non presenta traccia di crescita è quello inoculato con quell'aliquota di sospensione che aveva subito un trattamento sufficiente a uccidere tutte le cellule. Naturalmente, il tempo di inattivazione termica dipende dalle dimensioni della popolazione, in quanto sarà necessario un tempo più lungo per uccidere tutte le cellule di una popolazione di grandi dimensioni che non di una popolazione di dimensioni inferiori. Standardizzando il numero di cellule è, comunque, possibile confrontare la sensibilità al calore di organismi diversi semplicemente confrontando i rispettivi tempi di inattivazione termica. Ponendo in grafico il logaritmo del tempo di inattivazione termica contro la temperatura, si ottiene un grafico simile a quello illustrato nella Figura 8.24.

Le spore e la sterilizzazione mediante calore

Le endospore e le cellule vegetative sono molto diverse per quanto riguarda la rispettiva resistenza al calore. In una autoclave, per esempio, si raggiunge normalmente una temperatura di 121ºC in queste condizioni possono essere necessari 4 o 5 minuti per la riduzione decimale delle endospore, mentre per la riduzione decimale delle cellule vegetative sono sufficienti solo 0,l - 0,5 minuti. La pratica della sterilizzazione mediante calore risolve, quindi, il problema della sterilizzazione delle endospore.

Anche la natura del materiale che viene sottoposto a sterilizzazione influenza l'efficienza dell'eliminazione di spore e cellule vegetative. La morte batterica infatti è più rapida a pH acidi, ed è per questo motivo che cibi acidi, come i pomodori, la frutta e i sottaceti, sono molto più facili da sterilizzare di quelli a pH neutro, come il mais e i fagioli. Elevate concentrazioni di zuccheri, proteine e grassi si oppongono alla penetrazione del calore e di solito aumentano la resistenza dei microrganismi al calore. mentre elevate concentrazioni di sale possono sia aumentare che diminuire la resistenza al calore, in funzione del microrganismo. Cellule disidratate e spore sono più resistenti al calore delle cellule vegetative; per questo motivo la sterilizzazione mediante calore di materiali privi di acqua richiede sempre temperature più elevate e tempi più lunghi di quelli richiesti da materiali con un certo grado di umidità.

Le endospore sono le strutture maggiormente resistenti al calore finora note e sono in grado di sopravvivere a condizioni di riscaldamento che ucciderebbero rapidamente le cellule vegetative della stessa specie. Si ritiene che,uno dei fattori più importanti nel determinare, la resistenza al calore delle endospore sia la quantità e lo stato dell'acqua presente al loro interno, Durante la formazione dell'endospora, il volume del protoplasma viene molto ridotto in seguito all'accumulo di Ca²⁺ e alla sintesi di acido dipicolinico. che determinano la formazione di una struttura gelatinosa. A questo stadio si forma la spessa corteccia che circonda il protoplasma e la contrazione della corteccia provoca il restringimento del protoplasma e la fuoriuscita di acqua. Il contenuto di acqua del protoplasma determina il grado di resistenza al calore della spora. Se le endospore hanno un contenuto d'acqua relativamente elevato avranno scarsa resistenza al calore, e viceversa modificando il contenuto d'acqua delle spore si altererà la loro resistenza al calore. L`acqua può entrare e uscire liberamente dalle spore, così che non è tanto l'impermeabilità delle tuniche sporali che influenza il contenuto d'acqua quanto piuttosto lo stato fisico del protoplasma, cioè la quantità di dipicolinato di calcio formatasi.

L`autoclave

L`autoclave, uno strumento estremamente importante nella pratica microbiologica, assicura l'uccisione dei microrganismi, incluse le endospore, mediante l'utilizzazione di calore umido.

La sterilizzazione mediante calore prevede un trattamento che provoca la completa distruzione di tutti gli organismi e poiché le endospore sono praticamente ubiquitarie, le procedure di sterilizzazione vengono opportunamente programmate per la loro eliminazione. Per ottenere questi risultati è necessario raggiungere temperature superiori al punto di ebollizione dell'acqua, e ciò viene ottenuto immettendo vapore saturo sotto pressione nella camera a chiusura ermetica dell'autoclave (Figura).  Il principio è quello sfruttato dalle normali pentole a pressione, che infatti possono venire utilizzate con risultati soddisfacenti per sterilizzare piccole quantità di materiale. La pressione usualmente utilizzata per la sterilizzazione in autoclave è di l.1 kg/cm² (corrispondente a 1 atm di sovrapressione), che permette di raggiungere una temperatura di 121ºC; a questa temperatura il tempo di trattamento è generalmente di 10‑15 minuti. Se è necessario sterilizzare oggetti di grandi dimensioni, bisogna tenere presente che la diffusione del calore al loro interno sarà piuttosto lenta, e il tempo di sterilizzazione deve essere. quindi. sufficientemente lungo da consentire, anche alle parti più interne, di rimanere a 121ºC per 10‑15 minuti. Lo stesso vale per grandi volumi di liquidi: anche in questo caso sono necessari, per i motivi appena illustrati, tempi di sterilizzazione più lunghi del normale. E` necessario sottolineare che non è la pressione che si raggiunge all'interno dell'autoclave che provoca la morte dei microrganismi; il fattore letale è, infatti, l'elevata temperatura che si può raggiungere a pressioni superiori a quella atmosferica Il vapore è il vettore del calore.